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本研究旨在明確糖基轉移酶BpGT14基因在白樺生長發育中的功能，剋隆瞭白樺GT14基因全長序列和啓動子區，分析瞭其結構特徵和錶達模式，獲得瞭pRNAi-GG-BpGT14轉基因白樺。結果顯示：RNAi白樺莖橫截麵中木質部麵積增加瞭23%～47%，而韌皮部麵積比例無明顯變化；木質部中導管麵積為對照的1.82～2.16倍，韌皮縴維麵積比例無明顯變化。乾擾白樺縴維素含量無明顯變化，半縴維素、果膠質含量顯著降低，相比野生型分彆減少瞭約40%和10%，說明BpGT14在植物半縴維素、果膠質等細胞壁多糖閤成中具有重要作用。 

目錄
前言
1 緒論 1
1.1 糖基轉移酶簡介 1
1.2 糖基轉移酶功能 1
1.2.1 植物防禦反應 1
1.2.2 植物次生代謝産物修飾 2
1.2.3 植物次生細胞壁閤成 2
1.2.4 植物激素平衡 2
1.3 糖基轉移酶14研究進展 3
1.3.1 GT14/DUF266（GT14-like）蛋白的鑒定 3
1.3.2 GT14和GT14-like基因係統發育的關係 4
1.3.3 GT14和GT14-like基因的進化 4
1.3.4 GT14和GT14-like基因的錶達模式分析 4
1.3.5 GT14蛋白質三維結構及亞細胞定位 9
1.4 植物啓動子研究 11
1.4.1 啓動子結構及功能 11
1.4.2 啓動子剋隆方法 11
1.4.3 啓動子的應用 12
1.5 轉錄因子研究 12
1.5.1 轉錄因子簡介 12
1.5.2 轉錄因子分類及功能 12
1.6 轉錄因子與啓動子互作研究方法 13
1.6.1 酵母單雜交 13
1.6.2 免疫共沉澱 14
1.7 植物DNA甲基化的作用方式及功能 14
1.7.1 植物DNA甲基化的作用方式 14
1.7.2 植物DNA甲基化的功能 15
1.8 木本植物不同發育階段DNA甲基化水平和模式的變化 16
1.8.1 DNA甲基化與木本植物的年齡 17
1.8.2 DNA甲基化與木本植物的花期、休眠和育性 18
1.9 木本植物離體繁殖過程中的DNA甲基化模式重建 18
1.9.1 組織培養植株與野生植株的DNA甲基化水平和模式差異 19
1.9.2 再生過程、體胚發生、繼代培養及外植體狀態與DNA甲基化 20
1.10 植物DNA甲基轉移酶及與甲基化有關的蛋白質 21
1.10.1 METI傢族 21
1.10.2 CMT傢族 21
1.10.3 DRM傢族 22
1.11 白樺的生物學特性 23
1.12 研究意義 23
2 白樺BpGT14基因及其啓動子的剋隆及生物信息學分析 25
2.1 實驗材料 25
2.1.1 植物材料 25
2.1.2 菌株及載體 25
2.1.3 數據分析 26
2.2 實驗方法 26
2.2.1 白樺BpGT14基因生物信息學分析 26
2.2.2 白樺莖段懸浮細胞非生物脅迫處理 26
2.2.3 轉錄錶達定量分析 27
2.2.4 數據處理 27
2.2.5 白樺BpGT14啓動子的剋隆 27
2.2.6 啓動子生物信息學分析 30
2.2.7 植物錶達載體的構建 30
2.2.8 植物錶達載體農杆菌的轉化 32
2.2.9 BpGT14啓動子在煙草中的錶達活性 33
2.2.10 啓動子在白樺細胞中的錶達活性 33
2.3 結果與分析 34
2.3.1 白樺BpGT14基因的生物信息學分析 34
2.3.2 白樺BpGT14基因時空特異性錶達分析 37
2.3.3 白樺莖段懸浮細胞BpGT14基因非生物脅迫下錶達分析 38
2.3.4 白樺BpGT14基因啓動子剋隆 39
2.3.5 白樺BpGT14基因啓動子序列元件分析 40
2.3.6 啓動子pXGUS-P及pXGFP-P植物錶達載體的構建及鑒定 41
2.3.7 植物錶達載體轉化農杆菌的鑒定 42
2.3.8 非生物脅迫下啓動子在煙草中的錶達活性 42
2.3.9 啓動子在白樺細胞中的錶達活性 43
2.4 討論 45
2.5 本章小結 49
3 酵母單雜交篩選啓動子區及MYBPLANT元件結閤候選蛋白 51
3.1 實驗材料 51
3.2 實驗方法 51
3.2.1 啓動子1156bp片段PCR擴增 51
3.2.2 誘餌載體pAbAi綫性化及與啓動子片段的連接 51
3.2.3 MYBPLANT元件的構建 52
3.2.4 酵母感受態的製備 53
3.2.5 重組誘餌載體pAbAi轉化酵母感受態細胞 53
3.2.6 誘餌酵母的鑒定 54
3.2.7 報告基因在誘餌酵母中本底錶達水平的測定 54
3.2.8 白樺文庫cDNA的閤成 55
3.2.9 酵母單雜交文庫的構建及篩選 57
3.2.10 陽性剋隆菌株的鑒定 58
3.2.11 陽性剋隆cDNA插入片段的生物信息學分析 58
3.2.12 啓動子候選互作蛋白BpARF2基因的非生物脅迫響應 59
3.3 結果與分析 59
3.3.1 重組誘餌載體的構建 59
3.3.2 重組誘餌質粒轉化酵母感受態細胞 59
3.3.3 報告基因在誘餌酵母中本底錶達水平的測定 59
3.3.4 白樺文庫cDNA的閤成 60
3.3.5 酵母單雜交文庫的構建及篩選 61
3.3.6 陽性剋隆cDNA插入片段的生物信息學分析 61
3.3.7 啓動子互作候選蛋白BpARF2基因非生物脅迫響應 64
3.3.8 MYB-pAbAi重組誘餌載體的構建 67
3.3.9 MYBPLANT元件結閤候選蛋白的篩選 68
3.4 討論 68
3.5 本章小結 70
4 啓動子MYBPLANT元件結閤候選蛋白的鑒定 72
4.1 實驗材料 72
4.2 實驗方法 72
4.2.1 候選蛋白互作強弱初步鑒定 72
4.2.2 白樺BpAL4基因的剋隆 72
4.2.3 白樺BpAL4基因生物信息學分析 74
4.2.4 候選蛋白互作強弱初步鑒定 74
4.2.5 三次重復元件pCXGUS植物錶達載體構建 76
4.2.6 三親雜交及農杆菌的遺傳轉化 77
4.2.7 煙草中GUS基因錶達水平鑒定 78
4.2.8 非生物脅迫下白樺BpAL4基因錶達水平鑒定 78
4.3 結果與分析 78
4.3.1 候選蛋白互作強弱鑒定 78
4.3.2 白樺BpAL4基因的剋隆 79
4.3.3 白樺BpAL4基因生物信息學分析 79
4.3.4 白樺BpAL4基因植物錶達載體的構建 82
4.3.5 三次重復元件pCXGUS植物錶達載體構建 83
4.3.6 BpAL4蛋白及MYBPLANT元件共轉化分析 84
4.4 討論 85
4.5 本章小結 87
5 白樺BpGT14基因錶達載體及RNA乾擾載體的構建及遺傳轉化 88
5.1 實驗材料 88
5.2 實驗方法 88
5.2.1 白樺總RNA的提取與cDNA的閤成 88
5.2.2 白樺BpGT14基因pMD18-T載體的構建 88
5.2.3 白樺BpGT14基因乾擾載體的構建 89
5.2.4 三親雜交法轉化根癌農杆菌 89
5.2.5 根癌農杆菌介導的白樺遺傳轉化 90
5.2.6 轉基因植株的分子鑒定 91
5.2.7 轉基因白樺組培苗的移栽 92
5.2.8 石蠟切片 92
5.2.9 轉基因白樺木質素、縴維素、半縴維素和果膠的測定 93
5.3 結果與分析 96
5.3.1 白樺BpGT14基因pMD18-T載體的構建 96
5.3.2 白樺BpGT14基因乾擾載體的構建 97
5.3.3 三親雜交 97
5.3.4 轉基因植株的獲得 98
5.3.5 轉基因植株的分子鑒定 98
5.3.6 RNAi白樺莖段結構分析 99
5.3.7 BpGT14-RNAi轉基因白樺細胞壁成分分析 101
5.4 討論 103
5.5 本章小結 106
6 白樺微繁過程中BpGT14錶達及DNA甲基化的變異機製 108
6.1 實驗材料 108
6.1.1 植物材料 108
6.1.2 實驗器材 108
6.2 實驗方法 108
6.2.1 培養基及培養條件 108
6.2.2 外植體選取與消毒 109
6.2.3 腋芽增殖的繼代培養 109
6.2.4 愈傷組織的誘導及分化 109
6.2.5 再生植株生根及移栽 109
6.2.6 酶液製取 109
6.2.7 保護酶活性的測定 109
6.2.8 木質素測定 111
6.2.9 丙二醛含量測定 111
6.2.10 可溶性糖含量測定 111
6.2.11 可溶性蛋白含量測定 112
6.2.12 白樺DNA提取及亞硫酸鹽處理 112
6.2.13 BpGT14及甲基轉移酶基因錶達量分析 113
6.2.14 數據處理 115
6.3 結果與分析 115
6.3.1 愈傷組織的誘導和分化 115
6.3.2 甲基轉移酶基因的錶達 115
6.3.3 甲基轉移酶的活性分析 116
6.3.4 5′-CCGG的胞嘧啶甲基化水平 118
6.3.5 再生不同階段細胞氧化還原水平 120
6.3.6 再生不同階段變異的主成分分析 120
6.3.7 愈傷再生不同發育階段BpGT14基因錶達分析 124
6.3.8 白樺BpGT14基因內含子生物信息學分析 124
6.3.9 愈傷再生不同發育階段BpGT14基因啓動子及編碼區DNA甲基化變異 128
6.4 討論 131
6.4.1 甲基轉移酶基因在再生過程中的錶達 131
6.4.2 白樺組織培養中DNA甲基化的變化 131
6.4.3 微繁殖過程中的生理變化 132
6.4.4 不同發育階段的錶觀遺傳參數和生理指標的變化 133
6.4.5 愈傷再生不同發育階段BpGT14基因啓動子及編碼區DNA甲基化變異 133
6.5 本章小結 134
7 展望 136
參考文獻 137





1 緒論
　　1.1 糖基轉移酶簡介
　　糖基轉移酶（glycosyltransferase，GT）是一個重要的功能多樣化酶傢族，與多糖和糖苷的閤成密切相關。植物逐漸進化形成瞭GT大傢族，這個大傢族在植物的生長和發育過程中催化糖基化的一係列反應（Lao et al.，2014）。根據Carbohydrate-Active enZYmes（CAZy）數據庫，模式植物擬南芥基因組中編碼瞭超過450個糖基轉移酶，而水稻基因組包含600個成員（Coutinho et al.，2003）。
　　糖基轉移酶（GT；EC 2.4.x.y）可以催化活性糖基從供體分子轉移到受體分子，如糖類、核酸、脂質、蛋白質及各式各樣的有機化閤物（VoGTand Jones，2000）。糖基轉移酶一般在C 端保守，C端被普遍認為是識彆糖基的區域，而N 端因其不保守性則被認為是底物的識彆位點（Lairson et al.，2008）。糖基化對於生物體是一個關鍵的反應，到目前為止，CAZy數據庫定義瞭超過97個GT傢族（http：//www.cazy.org/）。復雜的碳水化閤物的閤成在植物體內尤為重要，這些物質控製植物體內各種分子功能、細胞與細胞的相互作用、信號及蛋白糖基化（Yonekura-Sakakibara and Hanada，2011）。寡糖和多糖的閤成涉及幾百種不同的糖基轉移酶，它們可以將糖基從活化的供體分子轉移到受體，糖基化特異性的目標分子（Breton et al.，2006）。因此，所有這些糖基轉移酶傢族在植物細胞的結構和功能方麵均扮演著重要角色。
　　1.2 糖基轉移酶功能
　　1.2.1 植物防禦反應
　　植物小分子糖基化對植物耐受逆境有著重要意義。擬南芥中一種糖基轉移酶UGT73B2被證明與植物氧化脅迫抗性有關（Kim et al.，2010），煙草中的一種糖基轉移酶能夠糖基化羥基香豆素、羥基甲氧基香豆素和羥基肉桂酸，並且在超敏反應中，水楊酸能夠上調其錶達（Fraissinet-Tachet et al.，1998）。同時有研究發現，在擬南芥中過錶達UGT74E2糖基轉移酶基因會使植物的抗旱及抗鹽性增強（Tognetti et al.，2010）。盡管已有研究錶明瞭糖基轉移酶基因與植物逆境脅迫相關，但其中的具體機製目前尚不清楚。
　　1.2.2 植物次生代謝産物修飾
　　植物次生代謝産物對植物的生長發育具有重要的作用，而糖基化對於次生代謝産物的形成有著關鍵意義。大量的次生代謝産物具有多種糖型，這些糖型可以影響它們的物理和化學特性（周文靈等，2009）。目前，已經發現大量參與次生代謝物形成的糖基轉移酶。擬南芥中，兩個糖基轉移酶基因UGT73C6和UGT78D1被發現與黃酮醇糖苷物的生物閤成相關（Jones et al.，2003）。甜葉菊的葉子中有大量雙萜化閤物積纍，而這些化閤物不同位置的糖基化導緻瞭其口感的不同（Richman et al.，2005）。同時有研究錶明，部分糖基轉移酶在植物苯丙烷途徑中扮演著重要的角色，它們可以通過糖基化改變分子的水溶性等各種特徵，起到調控作用（王會勇，2013）。植物木質素的閤成前體為苯丙烷衍生物，這意味著糖基轉移酶對植物木質素的閤成具有重要調控作用。
　　1.2.3 植物次生細胞壁閤成
　　細胞壁的成分中，90%左右是多糖，主要為縴維素、半縴維素和果膠類，糖基轉移酶參與細胞壁組分（縴維素、半縴維素和果膠）的閤成，催化各種分子的糖基化，因此對植物細胞壁的發育有著重要影響（Doblin et al.，2010；Sado et al.，2009）。GT傢族在植物中的重要功能為參與植物細胞壁多糖的閤成。細胞壁中*豐富的多糖是縴維素，一種綫性聚閤物，可以通過縴維素閤酶GT2傢族成員（CESA）在質膜中閤成（Liu et al.，2012）。多糖是具有分支的結構體，在高爾基體通過編碼閤成大量GT傢族成員後分泌到細胞壁形成彎麯交聯結構。蛋白質的糖基化發生在內質網和高爾基體，這是翻譯後修飾的一個*普遍體現（Yang et al.，2013a）。目前，對楊樹中糖基轉移酶的研究較為廣泛，對其轉錄圖譜進行分析發現，多個基因對植物次生細胞壁具有重要作用，同時分析發現，糖基轉移酶在楊樹木質部中參與瞭碳水化閤物的閤成和重構，進而直接影響木質部的發育（Williamson et al.，2002）。
　　1.2.4 植物激素平衡
　　植物體內的激素水平平衡對於植物的生長發育及對外界環境的響應具有重要的意義（王軍和侯丙凱，2008）。目前在植物體內，眾多激素的糖苷物均已被發現，這錶明激素的糖基化對於體內激素的調節有著重要的意義（Woodward and Bartel，2005）。目前認為，糖基化可以使激素活性降低或者消失（王軍和侯丙凱，2008）。擬南芥中對於UGT84B1 基因的過錶達植株研究錶明，該基因可導緻植株生長素缺失（Jackson et al.，2002），而赤豆中的一個脫落酸糖基轉移酶體外研究錶明，該基因産物可以使反式脫落酸糖基化（Xu et al.，2002）。目前，在煙草中，對水楊酸的糖基化研究較為全麵，同時擬南芥中也發現瞭水楊酸誘導的糖基轉移酶（王軍和侯丙凱，2008）。
　　1.3 糖基轉移酶14 研究進展
　　糖基轉移酶14 傢族屬於糖基轉移酶超傢族，該傢族在植物細胞壁閤成中扮演著重要角色（Richmond，2000）。對於生物乙醇的生産，細胞壁是*豐富的縴維素生物質來源，因此對糖基轉移酶14 調控細胞壁生長發育的研究，對於生物能源的開發具有重要的研究意義（Cao et al.，2008）。在擬南芥、水稻、楊樹、高粱和葡萄中（錶1-1），共鑒定瞭62個GT14基因和106個DUF266基因（目前有假設稱，DUF266 蛋白是一個新的GT分類，與GT相關，命名為GT14-like）（Yang et al.，2008）。對於這些GT14基因的係統發育分析將GT14和GT14-like基因分到瞭兩個不同的類彆，但蛋白結構域、3D構型和基因錶達分析揭露齣兩個類彆均屬於一個傢族，因此，將其命名為GT14/GT14-like傢族，包括兩個亞傢族（Ye et al.，2011）。
　　錶1-1 不同物種中GT14和GT14-like基因數目
　　在擬南芥和楊樹中，一半的GT14/GT14-like基因在莖和木質部優先錶達，暗示其在細胞壁閤成中的重要作用（Yang et al.，2013a）。AtGLCAT14A是擬南芥GT14傢族的一個蛋白質，擬南芥中有11個蛋白質屬於這個傢族，敲除該基因的突變體幼苗的胚軸和根的生長率提高，錶明該基因可能與細胞伸長相關（Liu et al.，2012）。
　　1.3.1 GT14/DUF266（GT14-like）蛋白的鑒定
　　為瞭驗證GT14和DUF266（GT14-like）蛋白是屬於同一個具有特殊支鏈蛋白結構域傢族的假說，作者用HMMER-InterProScan 的方法在5個已測序的植物物種中獲得瞭所有含有支鏈結構域的蛋白質序列（Yang et al.，2008）。5個已測序的植物物種包括一年生擬南芥（雙子葉植物）、水稻（單子葉植物）、楊樹（多年生雙子葉植物）、高粱（單子葉植物）和葡萄（多年生雙子葉植物），該研究共鑒定齣168個含有支鏈結構域的非冗餘的全長蛋白質序列，其中擬南芥中有33個、水稻中有31個、楊樹中有44個、高粱中有34個、葡萄中有26個。蛋白質序列的長度為75～651個氨基酸，平均長度為376個氨基酸。用HMMERInterProScan的方法所得到的蛋白質包含CAZy數據庫中11個擬南芥GT14傢族的蛋白質和水稻GT數據庫中12個GT14傢族的蛋白質，這錶明基因篩選的方法是有效的。
　　1.3.2 GT14和GT14-like基因係統發育的關係
　　對獲得的168個含有支鏈蛋白結構域的全長蛋白質序列構建係統進化樹，結果如圖1-1A所示，這168個蛋白質主要被分成兩個進化枝，分彆被命名為GT14和GT14-like。GT14-like蛋白先前被稱為DUF266蛋白，可被分成5 組（A1～A5），GT14蛋白可被分成8組（B1～B8）。用InterProScan軟件對這168個GT14和GT14-like的蛋白質序列進行功能分析（Hunter et al.，2009），共鑒定齣3個蛋白結構域：核心-2/1-分支酶功能域（IPR021141），GT14結構域（IPR003406），以及一個鈣離子結閤位點結構域（IPR018247）。如圖1-1B 所示，這三種結構域組成兩種類型的域結構，第*種類型是隻含有支鏈結構域，第二種類型是既含有支鏈結構域又含有GT14結構域。GT14蛋白的係統發育的進化枝隻包含第二種類型的域結構，GT14-like蛋白 白樺BpGT14 基因和啓動子的剋隆及功能分析 下載 mobi epub pdf txt 電子書

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