(1)研究人员可根据具体条件决定是用普通细胞还是用纯化T细胞作为应答细胞。普通细胞代表免疫细胞(包括巨噬细胞)所有补体,能够将同种异体抗原间接呈递给T细胞。与此相反,使用纯化T细胞检测ADSC作为抗原呈递细胞的能力需要呈递MHC分子同种异体抗原和表达共刺激分子。从技术角度来讲,纯化T细胞在低背景下对自体/同种细胞会产生更明显的效果,而对同种异基因细胞会产生更高的反应。使用普通细胞作为反应细胞可能与体内应答复制相关。从实践经验来讲,普通人PBMC对同种异基因BMSC产生的反应要高于同一供体来源的T细胞。
(2)由于样品在孔内沉积,很难从96孔微滴板中获取共培养的T细胞和ADSC,当“自动”获取细胞时,沉积物会阻碍过滤,引起孔内物溢出。为了方便培养,通常使用细胞收集器的“手动”模式在洗涤前吸取沉积物。
(3)如果反应细胞单独培养或与自体/同种细胞共培养产生高背景的反应(>1000cpm),有可能是培养液中存在有丝分裂或抗原成分等,如FBS。如果使用同源血清,则建议筛选出其他血清。培养期长也会导致高背景反应。因此,应该确定短期培养是否适用于本实验。
(4)使用供体反应细胞与刺激细胞的不同结合,可能增加同种异基因细胞的低阳性对照反应(< 10000cpm)。这些问题可以通过改变反应一刺激细胞比率,增加每孔细胞数,改变培养液中的血清成分或增加背景的FBS,以及调整培养时间或使用纯化T细胞作为反应细胞等方法解决。
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