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内容简介

生物医学常用实验技术涵盖医学院校研究生必须掌握的基本实验技术。生物医学常用实验技术按照不同的研究层面，分为五个部分：核酸技术、蛋白质技术、细胞技术、动物实验技术以及其他常用实验技术。内容涉及核酸、蛋白质等生物大分子的分离与检测，分子克隆的基本操作，组织细胞培养，动物实验基本操作以及常用的病理学技术。此外，也详细介绍了同位素标记生物大分子、流式细胞术、激光共聚焦检测等研究手段。

目录

第一章 核酸技术 1
实验一 质粒DNA的提取和纯化 1
实验二 DNA限制性内切酶酶切及回收 4
实验三 DNA转化及重组子的筛选和鉴定 6
实验四 RNA抽提与RT�睵CR 8
第二章 蛋白质技术 11
实验五 酶联免疫吸附试验 11
实验六 蛋白质定量分析 15
实验七 蛋白免疫印迹技术 18
实验八 组织切片技术与特殊染色 22
实验九 免疫组织化学技术 31
第三章 细胞技术 37
实验十 动物细胞的原代培养和传代培养 37
实验十一 MTT法评估细胞增殖活力 41
实验十二 细胞凋亡检测 43
第四章 动物实验技术 48
实验十三 动物实验基本技术（1） 48
实验十四 动物实验基本技术（2） 51
第五章 其他常用实验技术 55
实验十五 共聚焦激光扫描显微镜技术 55
实验十六 生物大分子的放射性核素标记技术 59
实验十七 流式检测技术 61
参考文献 72
彩图

精彩书摘

第一章核 酸 技 术生物医学常用实验技术·1·第一章核 酸 技 术实验一质粒DNA的提取和纯化质粒(plAsmid)是独立存在于细菌染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，质粒大小为1～200kb，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制体系合成质粒自身的DNA。质粒DNA是基因工程常用的基本工具。
【实验目的】
(1) 掌握质粒DNA的制备原理和方法。
(2) 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和实验方法。
【实验原理】
1�敝柿�DNA的制备与碱裂解法原理
(1) 质粒DNA的制备：包括3个步骤：1培养细菌，使质粒DNA大量扩增；2收集和裂解细菌；3分离和纯化质粒DNA。
(2) 质粒DNA的制备方法：主要包括：1碱裂解法：使用0��2mol NAOH与1%SDS；2煮沸裂解法：沸水煮沸40s；3SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验以碱裂解法为例提取质粒DNA。
(3) 碱裂解法的基本原理：质粒DNA 具有特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。首先，十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfAte，SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子，当pH介于12��0～12��5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性。尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。当加入pH4��8乙酸钾缓冲液时，pH恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构。复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态，通过离心就可去除染色体DNA和蛋白质�睸DS复合物等物质，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，乙醇或异丙醇沉淀就可得到纯的质粒DNA，之后还可再用超速离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。
2�鼻碇�糖凝胶电泳技术（AgArose gel electrophoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片段的有效方法。琼脂糖凝胶可分辨0��1～6��0kb的双链DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。上样缓冲液中含有0��25%溴酚蓝作为电泳指示剂。电泳时溴酚蓝泳动速度快于核酸，当溴酚蓝到达凝胶底部3/4位置时，即可停止电泳，进行结果观察。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙啶（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，借此可分析实验结果。
【实验材料】
pUC19质粒(具有氨苄西林抗性，Ampr)转化菌，LB培养基，氨苄西林，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNAse A母液（10mg/ml），TE缓冲液(pH 8��0)，Tris饱和酚，酚/氯仿/异戊醇混合液（25∶24∶1)，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，10mg/ml溴化乙啶(EB)，3mol/L 乙酸钾(pH 4��8)。
【实验仪器】
恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1��5ml离心管，50ml离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外透视仪，微量离心管等(图1��1)。
图1��1核酸电泳装置
A�钡缭矗籅�钡缬静奂爸平耗＞�
【实验方法】
1�敝柿�DNA的提取与纯化
(1) 接种pUC19质粒转化菌于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
(2) 取细菌悬液1ml于1��5ml EP管中，4000r/min，离心2min。
(3) 弃上清液，加入100μl溶液Ⅰ。
(4) 加入200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀，静置2min。
(5) 加入150μl溶液Ⅲ，颠倒混匀，静置5min。
(6) 4℃，12 000r/min，离心10min。
(7) 取400μl上清移入另一EP管，加等体积Tris饱和酚，颠倒混匀，12 000r/min，离心10min。
(8) 取约350μl上层水相移入另一EP管，加等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12 000r/min，离心10min。
(9) 取300μl上层水相移入另一EP管，加2倍体积无水乙醇，-20℃放置1��5h，沉淀DNA。
(10) 12 000r/min，离心10min，弃上清，加入1ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，小心吸弃乙醇。
(11) 室温5min干燥DNA，加入20μl TE缓冲液（含20μg RNAse A）溶解DNA，37℃水浴锅放置30min以降解RNA。
(12) 取5μl质粒DNA，与1μl 6×上样缓冲液混匀，1%琼脂糖凝胶电泳。
(13) 稳压110V，电泳40min，紫外灯下观察结果并拍照。
2�鼻碇�糖凝胶制备
(1) 将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。
(2) 称取DNA电泳用琼脂糖1g放入250ml的三角烧杯中，加入100ml 1×TBE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解，配制成浓度为1%的胶。
(3) 取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右（手握烧瓶可以耐受），再加入溴化乙啶（10mg/ml）5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液30ml。
(4) 室温下待凝胶完全凝固，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。
(5) 在电泳槽中加入1×TBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜，即可开始点样、电泳。
图1��2质粒DNA电泳图
【结果分析】
质粒DNA在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶电泳中，被染成橘红色。质粒DNA可以观察到3条带，电泳速度最慢的条带显色最浅(图1��2)。质粒DNA有3种构型，即共价闭合环状质粒(cccDNA)、开环质粒 (OCDNA)和线状质粒DNA (LDNA)。在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
【注意事项】
在加入细菌裂解液后，细菌基因组DNA与质粒DNA分离，细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子。此时应当上下颠倒轻轻混匀，以避免产生小分子质量的基因组DNA片段，最后污染提取的质粒DNA。
【思考题】
(1) 质粒的基本性质有哪些？
(2) 碱法提取质粒的原理是什么?
(3) 在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？
【试剂配方】
1�比芤孩瘢℅ET缓冲液）
Tris�睭Cl25mmol/L
EDTA10mmol/L
葡萄糖50mmol/L
pH8��0
2�比芤孩颍ū湫砸海�
NAOH200mmol/L
SDS1%
配制1ml溶液Ⅱ：取10% SDS 50μl、1mol/L NAOH 200μl，用灭菌去离子水定容至1ml，充分混匀，现用现配。
3�比芤孩�
醋酸钾3mol/L
pH4��8
4�� 6×DNA上样缓冲液
溴酚蓝0��25%
蔗糖水溶液40%（W/V）
5�� 5×TBE储存液
Tris碱1��1mol/L
硼酸900mmol/L
EDTA25mmol/L
pH8��0
6�� TE缓冲液
Tris�睭Cl10mmol/L
EDTA1mmol/L
pH8��0

（刘伟林旭）
实验二DNA限制性内切酶酶切及回收
【实验目的】
(1) 掌握DNA酶切技术的原理，熟悉双酶切反应。
(2) 掌握琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段的基本原理和操作方法。
【实验原理】
Ⅱ型限制性内切酶是分子生物学研究中经常使用的工具酶，它能识别和切割双链DNA分子中某一段特定序列的核苷酸。有的限制性内切酶在双链DNA两条链正好相对的位置上切割产生平末端，另一些限制性内切酶在两条链上交错切割，产生黏性末端。酶切反应需要一个理想的反应系统，要有Mg2+做辅助因子，并有一定的盐离子浓度，经特定的条件反应后，产生大小不同的片段，用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。当获得大小正确的片段需要做进一步的基因操作，可切取含该DNA片段的凝胶，利用核酸在缓冲液中与硅胶膜特异结合，在洗脱液条件下可被洗脱，得到纯化的目的DNA。
【实验材料】
纯化的质粒DNA，限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ，10×限制性内切酶缓冲液(10×Buffer)，10×牛血清白蛋白(10×BSA)，琼脂糖，双蒸水（ddH2O），DNA 标准分子质量，6×DNA上样缓冲液，1×TBE电泳缓冲液，0��5ml 微量离心管，冰盒，手术刀片，胶回收试剂盒[溶液Ⅰ（溶胶液）、溶液Ⅱ（洗涤液）、DNA纯化柱、废液收集管]。
【实验仪器】
恒温水浴箱，电泳仪，水平式凝胶电泳槽，紫外透视仪，移液器，台式离心机。
【实验方法】
1�彼�酶切反应如果外源DNA片段插入位点两端的酶切位点不同时，需进行双酶切反应。在可能的情况下，通常选择在同一反应体系下进行双酶切。反应体系可参照下例：
ddH2O10μl
10×BSA2μl
10×Buffer2μl
KpnⅠ0��5μl
XhoⅠ0��5μl（1~2mg）
纯化的质粒DNA5μl

总计20μl
37℃水浴，酶切2h，进行电泳分析。
2�鼻碇�糖凝胶回收DNA片段
(1) 切下含DNA的凝胶块，放入1��5ml 微量离心管。
(2) 加入300μl 溶液Ⅰ，65℃水浴10min，2min颠倒混匀一次，使胶完全融化。
(3) 混合液转移至已套入收集管的吸附柱内，室温放置2min，10 000g离心1min。
(4) 弃去收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管中，加500μl 溶液Ⅱ，10 000g离心1min。
(5) 重复步骤(4)。
(6) 倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，10 000r/min空柱离心2min。
(7) 将吸附柱放入一干净的1��5ml的EP管中，室温放置2min使乙醇挥发，在吸附柱中膜的中央加入20μl 65℃预热的双蒸水进行洗脱，室温静置3min，10 000g离心1min，离心管中即为回收的DNA片段。
【结果分析】
结果分析见图1��3。
图1��3质粒酶切示意图
【注意事项】
(1) 反应体系中甘油终浓度必须小于5%，防止抑制酶活性（由于商品化的Ⅱ型限制性内切酶含50%甘油，因此需稀释10倍以上）。
(2) 各Ⅱ型限制性内切酶的最佳作用温度不尽相同，使用前务必查看说明书。
【思考题】
DNA片段酶切后产生的切口类型有几种？

（丁亚兰陈婉南）
实验三DNA转化及重组子的筛选和鉴定
体外重组后的DNA分子，需按照一定的方式导入宿主细胞。转化（trAnsformAtion）指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CACl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。本实验以CACl2化学试剂法介绍感受态的制备及转化。
【实验目的】
(1) 掌握转化的基本原理及操作步骤。
(2) 掌握重组子的筛选和鉴定的原理和方法。
【实验原理】
大肠杆菌的转化常用化学法（CACl2法），该法最先由Cohen于1972年建立。其原理是细菌处于0℃及0��1mmol/L CACl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNAse的羟基�哺屏姿岣春衔镳じ接谙赴�表面，经42℃ 2min热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。常用的筛选方法有抗生素筛选、插入失活筛选、蓝白斑筛选等，本实验利用蓝白斑筛选来获得重组子。
蓝白斑筛选基于α�不ゲ瓜窒螅�其基本原理为：某些载体（如pUC系列载体）带有β�舶肴樘擒彰福↙AcZ）α�搽模∟端146个氨基酸）的编码区，区内具有多克隆位点，与此相对应的含LAcZ△M15基因型的菌株（LAcZ △M15基因由噬菌体介导整合至菌株染色体上，常用菌株有E.coil Top10及DH5α）编码LAcZ C端300个氨基酸。正常情况下，载体转化至宿主菌后，在诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，载体产生α-肽，与宿主产生端300个氨基 酸结合形成具有完整活性的LAcZ，能够将底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（X-GAl）代谢为蓝色产物,使菌落呈蓝色。而在重组载体中，外源DNA片段破坏α-肽编码区，重组载体转 至相应宿主菌后产生无活性α-肽，与宿主产物不能形成有活性的LAcZ，因此，X-GAl不被降 解，形成半透明菌落(即通常所说的白色菌落，为大肠杆菌正常的菌落形态)。因此，只要通 过观察菌落颜色即可判断是否为含外源DNA片段的重组载体。
【实验材料】
1.5ml微量离心管，培养皿，涂布棒，酒精灯，含氨苄西林LB琼脂平板，LB液体培养基， 新鲜配制高压灭菌的0.1mmol/L CACl2溶液，重组质粒DNA，IPTG, X-GAl。
【实验方法】
(1)接种E.coil DH5α单菌落细菌于5ml LB培养基。
⑵取细菌，按1:100接种于5Ml L培养基，摇育3h（对数生长期，OD600=0-4~0.6）
(3)取1mL细菌，冰浴30min。
(4）4℃，2500g离心5min。
(5）弃上清，沉淀加1mL 0.1mol/L（冰预冷），轻柔地重悬细菌,冰浴30min。
（6）4℃，2500g离心5min。
（7）弃上清，加入2000μL冰CACl2轻柔地重悬细菌。

前言/序言

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