适读人群：本书既有对实验方案的详细描述，又有对各种实验方案的原理解释和分析探讨，具有操作规范、要点突出、分析透彻、可行性强的特点，是一本非常实用的蛋白质纯化技术工具书。本书既可供从事蛋白质科学研究的科技工作者和研究生作为实验操作指南，也可供生命科学其他领域的研究者作为参考用书。
　　《蛋白质纯化指南》的第一版在二十年前出版，一直被广泛用来指导学生和研究人员纯化、鉴定、处理蛋白质和酶。这一新版本修改和更新了内容，但仍然延续了本书的传统，呈现清晰、易于遵循的方式，使专家和新手科学家都可以成功地掌握实验室的前沿技术和经典方法。

内容简介

　　蛋白质生物化学仍是现代生物学研究的重要部分。随着基因组测序的深入进行，多数物种的基因组序列已知，有益于基因克隆、蛋白质合成及蛋白质性质、结构和功能的研究。同时重组蛋白质异源表达技术的迅速发展，使人们更容易合成所需要的蛋白质。但是蛋白质合成以后还需纯化和研究其特性，特别是蛋白质编码基因未知的情况下，这一点尤为重要。

作者简介

　　Richard R. Burgess，美国威斯康星州，威斯康星大学麦迪逊分校，McArdle癌症研究实验室；Murray P. Deutscher，美国佛罗里达州，迈阿密大学医学院，生物化学和分子生物学系。

前言
撰稿人
第1章序言
第1章为什么要纯化酶？
第1部分制定纯化流程
第2章蛋白质纯化的策略与考虑因素
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4�贝笈�量纯化步骤
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参考文献
第3章生物信息学在蛋白质纯化设计中的应用
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3�苯崧踈n
参考文献
第4章准备纯化工作简表
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2�苯抛⒌闹匾�性
3�� SDS�睵AGE对分析主要蛋白质分离组分的价值
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第2部分操作蛋白质和酶的常规方法
第5章建立一个实验室
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第6章缓冲液：原理和实践
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参考文献
第7章酶活性的测定
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2�贝呋�活性的原理
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4�狈从Ψ治龌旌衔锏淖槌蒤n
5�碧致踈n
参考文献
第8章蛋白质定量
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3�弊贤馕�收光谱分析
4�被�于染料的蛋白质分析方法
5�笨悸硭沽晾兜鞍字逝ǘ确治龇�

精彩书摘

　　第1章序言
　　怀着极大的敬意，我们在第二版将本书第一版完整的第1章，由已故的Arthur Kornberg所著的“为什么要纯化酶”重印。Arthur是20世纪生物化学领域的一位巨匠，他的强项就是酶学——在阅读本章节时，读者们将充分领会到个中缘由。Arthur的言语中洋溢着他对于鉴定某种酶的活性，并且将该酶纯化至均质（homogeneity）从而可以直接研究其特性的热情。不过他显然也清楚地意识到了酶的“社会性”（social face），也就是酶类与其他细胞组分的相互作用——由于我们现在进而开始研究细胞组织结构的重要性，酶类的这种“社会性”使其获得了更多的关注。
　　自这个章节撰写近20年来，本领域取得了很多进展，特别是当其基因已知时，相应蛋白质的纯化变得容易很多。然而，当你在研究某种酶的催化特性时，或在解析某种蛋白质的结构时，或是鉴定可能的调节因子时，“纯度，纯度，还是纯度”的告诫依然是极有意义的。当试图了解一个新近发现的细胞反应中的酶类，或是参与某个细胞过程的蛋白质时，蛋白质的纯化依然是头等重要的事情。因此，不管是第一次读，还是重读回味，Arthur所著的精彩明晰的章节都会让你有所收获。
　　Murray P�� Deutscher
　　(徐俊杰译)蛋白质纯化指南(原书第二版)第1章为什么要纯化酶？
　　第1章　为什么要纯化酶？
　　Arthur Kornberg已故
　　“不要把你纯粹的思想浪费在不纯的酶上！”，这是酶学与化学实践的核心人物Efraim Racker的告诫。这句话只是想告诉我们，在将感兴趣的酶从由其他的酶和物质组成的粗制细胞提取物中分离纯化出来之前，试图研究该酶是如何催化一种物质转化为另一种物质通常都是在浪费时间。从破裂的肝脏、酵母或细菌细胞中释放出来的上千种不同酶类的混合物可能含有一些指导原料进行其他重排反应的酶类和特定酶功能的产物。只有当我们将酶纯化到检测不到其他酶活性的程度，我们才能确信，一种单一类型的酶分子仅仅是催化物质A转化成物质B。只有这时，我们才能了解这种酶是如何进行反应的。
　　纯化酶的努力所获得的回报在Otto Warburg于19世纪30年代发表的一系列振奋人心的文章中得到了阐明。凭借着出自他在Berlin�睤ahlem的实验室的诸多酶纯化的方法和准则，呼吸过程和糖酵解过程中的关键反应及维生素功能得以阐明。Warburg的贡献在于他强化了经典的酶学方法，该方法始于20世纪之交Eduard Büchner对无细胞条件下蔗糖可转化为乙醇的偶然发现。科学家首先通过在无细胞系统中观察到的现象，追踪到细胞功能（如酵母中的乙醇发酵、肌肉中的糖酵解、萤火虫发光或DNA的复制）的分子基础。然后再通过将细胞提取物分成几部分并将其纯化至单一成分，以分离相应的酶（或多个酶）。接下来，科学家们希望可以充分了解酶的结构，从而可以解释该酶如何行使催化功能，如何响应调控信号，以及如何与细胞中的其他酶类和结构联系。
　　借助一个近几十年特别流行的被称为“新古典主义”（neoclassical）的反向过程，科学家首先得到一种蛋白质的结构，然后探索其功能。这种蛋白质最好是分子小且稳定的，可以通过分子克隆扩增，或是可购得商业化产品。通过对该蛋白质及其同源蛋白的深入研究，科学家们期望能得到其如何行使功能的线索。随着“新古典主义”方法越来越受欢迎，人们对传统的研究路线（即从功能入手，以分离相应的结构）的兴趣也在相应下降。
　　对于一个能够在试管中重建一个细胞可做的任何事情的热诚的生物化学家而言，对酶纯化的发自内心的热忱就是他的信条。实际上，生物化学家利用操作介质（pH、离子强度等）的优势，可通过提高反应物浓度，或是使产物与反应体系分离等方法，更容易进行这些研究。生物化学家的另一个信条是，所有在细胞中进行的反应都是由酶来催化的。化学家有时候会觉得这个说法很难接受。
　　最近，一位审慎而有名的物理化学家告诉我，我的工作中最吸引他的是DNA的复制居然是由酶来催化的！这让我想起1953年到圣路易斯时，我在华盛顿大学化学系做的一个报告。当我讲述合成和降解乳清酸的酶时，发现听众们正在迅速地溜走。也许他们原本打算听到一些关于乳清酸的有机合成的内容。我使出最后一招，希望能够挽回他们的注意，于是我大声地说，细胞中的每一个化学事件都依赖于一个酶的作用。这时，Joseph Kennedy（现在已故）这位才华横溢的年轻主席突然警醒，说：“你的意思是说就像二氧化碳的水合作用（生成碳酸）那么简单的事情也需要酶？”上帝总算把他交给我了。“是的，Joe，细胞中的确有这个酶，称为碳酸酐酶。它可以令这个反应的速率提高100万倍以上。”
　　酶是令人敬畏的机器，它们具有合适的复杂度。你可能会因努力应付单细胞操作的事情而心神不宁，更不用说那些多细胞生物了；或者，你可能对探测小分子的精细化学而感到无力。熟悉某种酶在主要合成路径中的表现是恰当的做法。为了充分了解酶，必须首先将酶纯化至接近均一。为了将含量为细胞群落中的成千上万种蛋白质的1%的1/10或1/100的某一蛋白质种类分离出来，需要好好策划，并且需要参照快速可靠地检测其催化活性的检测方法。
　　没有酶能被纯化至绝对的均一。即便在其他蛋白质组分低于纯化蛋白质的1%，并且用最好的检测方法都检测不到时，在反应混合物中依然可能存在几百万种外源分子。通常，这些污染物不会有影响，除非它们属于占优势的一类，并且在研究的组分中具有极高的活性。
　　只有在了解了纯酶的性质之后，研究其在粗酶状态下的行为才是有意义的。“不要把你纯粹的思想浪费在不纯的酶上”就是明智的信条。我从来不会吝啬于将时间花费在酶的纯化上，不管它是导致了一个反应路径的阐明，新酶的发现，独特的分析剂的获得，还是仅仅获得了纯化过程的实验技能。所以，应强调的是纯度，纯度，还是纯度。
　　纯化酶的整个过程都是有所回报的，从一开始在破碎细胞的大群的蛋白质中将其释放出来，直到最后将其出色的分离。当将酶从其舒适的细胞巢中取出来时，重要的是需要注意许多不利的因素：高度稀释于不利的溶剂中，接触玻璃表面及严苛的温度，暴露于金属、氧及数不胜数的其他危险中。酶纯化的失败常常归因于其脆弱性及易于变性的特点，但是也应该归咎于科学家的“变性”。正如家长为孩子的行踪和安全担心一样，你不能在不知道这一天的操作步骤纯化到了多少酶，有多少污染的蛋白质依然存在的情况下，就在晚上离开实验室。
　　为了达到纯化蛋白质的目的，基本的准则是，将酶活性与总蛋白的比率提高至极限。必须严格地记录每一个操作步骤和每一个阶段中蛋白质的活性单位及数量。在这种情况下，酶纯化的实验记录应该经得起审计员和银行监察员的仔细查阅。这并不是说你应该将这个实验作为生意或者是银行来经营，因为它常常看起来像是需要攀登的未知山峰：逻辑喜欢那些成功地提供更高地基的野营地的人。蛋白质的“死亡率”和令人困惑的污染物就如同遭遇不能预料的暴风雨及困境的历险一样；一路上悦人的风景满足了关于在顶峰将会看到什么的期待。纯化酶的最终奖赏相当于在顶峰居高临下地看到的一览无余的美丽风景。此时超越了宏大的远景和最先到达的激动，已经没有必要下山，而是会去勘察更有吸引力的山峦，每一座高山都许诺会有更宏伟的景色呈现。
　　利用纯化的酶，我们能了解其催化活性和其对调控分子（可提升或降低酶活性）的响应。除了催化和调控方面，酶还有一张“社交”的面孔，可以控制与其他酶类、核酸和膜表面的关键性相互作用。为了获得酶对细胞体系的贡献的观点，我们也必须确定诱导或抑制负责产生酶的基因的因子。追踪代谢或生物合成的酶揭示了细菌根据自己变化的需求而调控酶的产生的不可思议的复杂性。
　　目前公众的兴趣集中在认识果蝇及线虫的生长和发育，以及它们的细胞和组织。许多实验室致力于研究癌症的异常，并期望它们的研究将为正常的模式提供思路。同时，巨大的努力都投入了对AIDS研究，关注于病毒本身，以及其对免疫系统的破坏作用。在上述研究中，对于细胞基因组、病毒功能的操作尝试几乎总是在完整的细胞和生物体中监测的。很少有人尝试在无细胞体系中检测整个过程中的某一个阶段。当今生物学研究依赖完整细胞和生物体，以推测它们的化学过程，这是现代版的生机论（vitalism）。生机论最早由巴斯德提出，并且包含在这之前和之后的许多代生物学家的看法中。
　　令我感到疑惑的是，人们通常总是忽略了用绝对简单且经过验证的酶学方法解决基础的代谢问题。在能够解释更复杂的现象之前，必须了解分离的物质及其相互作用，这条箴言已经植根于生物化学的历史中，并且现在被完全地常识化。Robert Koch在一个世纪之前，在鉴定某传染病的致病物时教导我们，必须最先从所有微生物中分离出这种致病微生物。有机化学家甚至更早就知道我们必须通过纯化和结晶以证明某种物质的特性。历史上更近一些时候，维生素发现者们发现如果不把每一种维生素都分离为纯化形式，试图发现其代谢和营养作用都是空谈。因此，只有利用纯化的酶，我们才能清楚地鉴定负责一个独立的代谢活动的分子机器的每一个组件。由于对此深信不疑，我的一个研究生将其表达在了他的个性化车牌上（图1��1）。
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