前言
實驗一DNA的提取1
實驗二核酸的定量8
實驗三真核細胞總RNA的提取11
實驗四PCR擴增目的基因17
實驗五RT-PCR25
實驗六DNA瓊脂糖凝膠電泳31
實驗七從瓊脂糖凝膠中迴收DNA片段36
實驗八目的基因片段與載體的連接39
實驗九用氯化鈣法製備新鮮的大腸杆菌感受態細胞42
實驗十重組DNA的轉化44
實驗十一DNA酶切48
實驗十二轉化剋隆的篩選和鑒定52
實驗十三質粒DNA的分離純化55
實驗十四含甘油培養物保藏法65
實驗十五Southernblot分析67
實驗十六Northernblot分析74
實驗十七實時定量PCR技術78
實驗十八環介導等溫擴增技術87
實驗十九mRNA差異顯示技術93
實驗二十外源基因在大腸杆菌中的誘導錶達97
實驗二十一SDS-PAGE檢測蛋白質的錶達100
實驗二十二Westernblot檢測蛋白質的錶達107
實驗二十三雙嚮電泳技術114
實驗二十四DNA甲基化的檢測138
實驗二十五哺乳動物細胞中的RNA乾擾技術141
實驗二十六小鼠血漿microRNA提取技術144
實驗二十七DNA芯片技術檢測病原147
實驗二十八TALEN載體的設計與構建149
實驗二十九TALEN定點製備及篩選突變體155
實驗三十CRISPR/Cas9介導的基因組定點編輯技術157
主要參考文獻163
附錄166

作者簡介

吉林大學一綫教師

內頁插圖

《分子生物學實驗原理與技術實驗》共列三十個分子生物學實驗及其相關附錄，內容不僅涵蓋瞭基因剋隆、基因錶達、核酸及蛋白分子雜交等分子生物學常規實驗，也包括基因檢測、基因打靶、RNA乾擾、蛋白分析等新型的分子生物學技術。每個實驗包括原理介紹、實驗操作、常見問題及注意事項。在介紹原理和流程過程中，穿插一些實用的重點提示、試劑作用及可能齣現的現象。《分子生物學實驗原理與技術實驗》所列的實驗流程均是編者們正在使用的、在教學中進行過實踐的、切實可行的方法；所列常見問題及注意事項均是多年科研工作及教學實踐的總結積纍。

精彩書摘

實驗一DNA的提取
【實驗目的】
瞭解DNA提取的基本原理，掌握DNA的提取方法
【實驗原理】
遺傳信息全部儲存在DNA -級結構之中，製備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整
一分離純化DNA的原則
(l)保持DNA分子一級結構的完整性溫度不要過高;控製一定的pH範圍(pH5~9)，保持一定的離子強度，減少物理因素對核酸降解的機械剪切力
(2)防止DNA的生物降解細胞內或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構因此，所用器械和一些試劑需要高溫滅菌，提取緩衝液中也需要加核酸酶抑製劑
二分離提取核酸的主要步驟
(一)細胞的破碎
細胞破碎的常用方法有以下幾種
(l)高速組織搗碎機搗碎;
(2)玻璃勻漿器勻漿;
(3)超聲波處理法;
(4)液氮研磨法;
(5)化學處理法(SDSTween-80等);
(6)生化法(溶菌酶縴維素酶等)
(二)核蛋白的解聚變性蛋白的去除
核酸與蛋白質的結閤力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結閤)氫鍵和非極性的範德華力分離核酸最睏難的是將與核酸緊密結閤的蛋白質分開，同時避免核酸降解
提取DNA的一般過程足將分散好的組織細胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液再經過乙醇沉澱，使DNA從溶液中析齣
蛋白酶K能在SDS和EDTA-2Na存在下保持很高的活性在勻漿後提取DNA的反應體係中，SDS可破壞細胞膜核膜，並使組織蛋白與DNA分離，EDTA-2Na則抑製細胞中DNA酶(DNase)的活性;而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離齣來
常見的DNA酶抑製劑如下:
(l)金屬離子螯閤劑DNA酶需要金屬二價離子Mg2+Cap_的激活，因此使用金屬二價離子螯閤劑，可抑製DNA酶活性如EDTA-2Na等
(2)陰離子型錶麵活性劑如SDS，該試劑除對核酸酶有抑製作用外，還能使蛋白質變性，並與變性蛋白結閤成帶負電荷的復閤物，該復閤物在高鹽溶液中易於沉澱
常用DNA提取原理如下
(l)加入10倍體積的緩衝液:10 mmol/L Tris-HCI (pH 7.4)，150 mmol/L NaCI，10 mmol/L EDTA，0.50/ SDS其中，NaCI破壞核酸一蛋白質間的靜電引力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚;EDTA破壞細胞膜螯閤Ca2_，使DNase失活;SDS可破壞細胞膜抑製核酸酶，還可使核酸從蛋白質上遊離m來
(2)加入蛋白酶K蛋白酶K是一種非特異性蛋白酶，它可將蚤白質消化成氨基酸一般工作濃度是50--100 ug/mL反應時間大於5h，反應溫度55℃
(三)核酸的沉澱
沉澱是濃縮核酸最常用的方法優點:改變核酸的溶解緩衝液;重新調整核酸的濃度;去除溶液中某些鹽離子與雜質
1.常見的用於DNA沉澱的鹽類及濃度(錶1-1)
2.有機沉澱劑
(1)乙醇優點:對鹽類沉澱少，沉澱中所含少量乙醇易揮發除去缺點:需要量大(2~3倍體積)
(2)異丙醇優點:需體積小，速度快，適於濃度低體積大的DNA樣品沉澱一般不需低溫長時間放置缺點:易使鹽類蔗糖與DNA共沉澱;異丙醇難以揮發除去
(3)聚乙二醇(PEG)優點:可用不同濃度的PEG選擇沉澱不同相對分子質量的DNA片段應用PEG600進行DNA沉澱時，使用濃度與DNA片段的大小成反比注意:PEG沉澱一般需要加入0.5 mol/L的NaCI或10 mmol/L的MgClp;
(4)精胺(spermine)精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉澱DNA原理:精胺與DNA結閤後，使DNA在溶液中結構凝縮而發生沉澱，並可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分開，達到純化DNA的目的
3.核酸沉澱的溫度和時間
核酸沉澱應該在低溫下長時間進行若溶液中核酸濃度很高，在鹽離子存在的情況下，加入異丙醇等後即可看到DNA的絮狀沉澱若溶液中核酸濃度很低，則需在-20℃條件下過夜酵母tRNA可有助納剋(ng)級的核酸沉澱大於10 ltg/mL的核酸，冰浴10 min即可有效沉澱
(四)核酸的保存
1.DNA
DNA樣品溶於pH 8.O的TE緩衝液中，4℃或-20℃保存，或者加1滴氯仿-70℃可保存數年
2.RNA
(l) RNA樣品溶於含0.3 mol/L NaAc (pH 5.2)的2倍體積的乙醇中，-70℃保存
(2)在RNA溶液中加1滴氯仿或0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復閤物)凍存於-70℃，可保存數年
(五)常見基因組DNA提取方法
1.基因組DNA提取-CTAB法(植物DNA提取經典方法)
十六烷基三甲基溴化銨( hexadecVlt rimethvlammoniumbro mide，CTAB)是一種陽離子去汙劑，可溶解細胞膜，並與核酸形成復閤物該復閤物在高鹽溶液中(>0.7 mol/LNaCI)是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白質多糖酚類等雜質盾加入乙醇沉澱即可使核酸分離m來CTAB提取緩衝液經典配方及改進配方見錶1-2和錶1 3
錶1-2CTAB提取緩衝液的經典配方
錶1-3CTAB提取緩衝液的改進配方
CTAB窪實驗流程見圖1-1
2.基因組DNA提取——SDS法
SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫(55--65℃)條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放齣核酸;然後，提高鹽(KAc或NHd Ac)濃度並降低溫度(冰浴)，使蛋白質及多糖雜質沉澱，離心後除去沉澱;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提後用乙醇沉澱水相中的DNA
SDS法適用於大部分實驗材料的基因組DNA提取，如動物組織細胞全血細菌SDS法實驗流程見圖1-2(以動物組織為例)
圖1-2SDS法實驗流程
(六)幾種常見細胞或組織DNA的提取
1.細菌基因組DNA的製備過程
(l)細胞裂解0.6倍體積的異丙醇或2倍體積乙醇(可以加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨輔助沉澱)
(2)DNA純化CTAB除去多糖，酚氯仿一異戊醇除去蛋白質
(3)沉澱DNA10% SDS和蛋白酶K
2.哺乳動物細胞基因組DNA的抽提過程
(l)組織粉碎動物組織剪成小塊，置液氮中凍結後研磨成細粉末;組織培養的細胞用胰酶消化鬆散後直接使用
(2)細胞裂解0.5% SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K，50℃溫育
(3)沉澱DNA用2倍體積的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇(加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨可以輔助沉澱)
3.從植物組織中製備DNA
(l)組織粉碎用液氮冷凍後研磨成細粉末
(2)細胞裂解用20/ CTAB/13-ME(十六烷基三甲基溴化銨/p巰基乙醇)或l%SDS和蛋白酶K，65℃溫育
(3)沉澱DNA:用0.6倍體積的異丙醇(-20℃)(可以加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨輔助沉澱)
【實驗用品】
1.材料
動物組織
2.器材和儀器
(1)恒溫水浴鍋
(2)颱式離心機
(3)紫外分光光度計
(4)移液器
(5)玻璃勻漿器
(6)離心管(滅菌)
(7)吸頭(滅菌)等
3.試劑
(l)細胞裂解緩衝液
Tris(pH 8.O)100 mmol/L EDTA (pH 8.O)500 mmol/L
NaCI20 mmol/L
SDS100
胰RNA酶20 ltg/mL
(2)蛋白酶K稱取20mg蛋白酶K溶於1mL滅菌的雙蒸水中，-20℃備用
(3)TE緩衝液(pH 8.O)高壓滅菌，室溫保存
(4)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)
(5)異丙醇
(6)預冷無水乙醇
(7)70g乙醇
(8)滅菌水
(9)TIANamp Genomic DNA kit (DP304)斌劑盒
【實驗內容】
1.方法一
(l)取新鮮或冰凍動物組織塊0.19(0.5 cm:i)，盡量剪碎置於研鉢研碎，加入1 mL的細胞裂解緩衝液勻漿至不見組織塊，轉入1.5mL離心管中，加入蛋白酶K(500 ljg/mL)20 ljL，混勻在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min(也可轉入37℃水浴12~24 h)，間歇振蕩離心管數次在颱式離心機上，以12000g離心5min，取上清液人另一離心管中
(2)加2倍體積異丙醇，倒轉混勻後，可以看見絲狀物，用100 LiL吸頭挑齣，晾乾，用200 ljL TE重新溶解(可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行)
(3)加等量的酚/氯仿/異戊醇振蕩混勻，12000g離心5 min
(4)取上層溶液至另一管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，12000g離心，5min
(5)取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5 mol/L乙酸銨和2倍體積的無水乙醇，混勻後室溫沉澱2 min，12000g離心10min
(6)小心倒掉上清液，將離心管倒置於吸水紙上，將附於管壁的殘餘液滴除掉
(7)用1 mL 70%乙醇洗滌沉澱物1次，12000 9離心5 min
(8)小心倒掉上清液，將離心管倒置於吸水紙上，將附於管壁的殘餘液滴除掉，室溫乾燥
(9)加200 UL TE重新溶解沉澱物，然後置於4℃或-20℃保存備用
(10)吸取適量樣品於紫外分光光度計上檢測濃度和純度
2.方法二
使用TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)誠劑盒提取DNA
(l)動物組織(小於10mg)用液氮研磨後，加入200 FiL緩衝液GA，振蕩至徹底懸浮
(2)加入20uL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，混勻，56℃放置，直到組織溶解
(3)加入200uL緩衝液GB，充分顛倒混閤，70℃放置10min，直到溶液變清亮
(4)加入200uL無水乙醇，充分振蕩混閤15s
(5)將所有溶液及絮狀沉澱加入到吸附柱CB 3中(吸附柱放人收集管中)，12 000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放迴收集管中
(6)嚮吸附柱中加入500uL緩衝液GD，12000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放迴到收集管中
(7)嚮吸附柱中加入700uL漂洗液PW，12000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放迴到收集管中
(8)嚮吸附柱中加入500uL漂洗液PW，12000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放迴到收集管中
(9)將吸附柱放迴收集管中，12 000g離心2min;
(10)將吸附柱放到一個乾淨離心管中，加入 TE緩衝液，室溫放置3min，離心2min，收集到的溶液即為DNA溶液
【注意事項】
(l)選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不要過長
(2)在加入細胞裂解緩衝液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成
(3)提取的DNA不易溶解，可能的原因:DNA不純，含雜質較多;加溶解液太少使濃度過大;沉澱物太乾燥，也會使溶解變得很睏難
(4)電泳檢測時DNA成塗布狀，可能的原因:操作不慎;汙染核酸酶等